Η πιο καθοριστική περίοδος για το φρούριο ήταν η 2η Ενετική Περίοδος. Οι Ενετοί, όντας συνεχώς υπό την απειλή των Οθωμανών, χρησιμοποίησαν ως όπλο την αμυντική τους τεχνογνωσία και απέκρουσαν και τις 3 οθωμανικές πολιορκίες. Για να το πετύχουν έκαναν αμυντικές παρεμβάσεις, τόσο στην πόλη όσο και στο φρούριο. Αρχικά, μετέτρεψαν τη χερσονήσο του φρουρίου σε νησί, δημιουργώντας μια τεχνητή θαλάσσια τάφρο, την Contrafossa. Η σύνδεση με την ξηρά γινόταν με ξύλινη κινητή γέφυρα που συνέδεε την είσοδο του φρουρίου, την Porta Maggiore, με την ξηρά. Επίσης, ισοπέδωσαν τα κτίσματα μπροστά στο φρούριο και κατασκεύασαν την πλατεία Σπιανάδα ως πεδίο βολής. Επίσης, αναδιαμόρφωσαν τους προμαχώνες δεξιά και αριστερά της εισόδου, οργάνωσαν στρατιωτικό λιμένα, πρόσθεσαν φυλακές, αποθήκες πυρομαχικών κ.ά.